無縫克隆試劑盒基于同源重組原理，通過插入片段與線性化載體末端的同源序列(15-25 bp)實現定向重組，無需酶切與連接步驟，具有操作便捷、陽性率高(可達95%以上)、支持多片段重組等優勢。
無縫克隆試劑盒其使用流程可分為以下三個核心步驟：
一、線性化載體制備
酶切法
雙酶切：選擇載體中兩個不同的酶切位點，用限制性內切酶消化載體，通過凝膠電泳分離并回收線性化載體。雙酶切可降低載體自連背景，提高陽性率。
單酶切：若無可選雙酶切位點，可采用單酶切，但需延長酶切時間(2小時至過夜)并進行脫磷處理(如CIP處理20分鐘)，以減少自連假陽性。
注意事項：酶切后需通過膠回收純化線性化載體，避免環狀質粒殘留；若載體長度超過10 kb，建議延長酶切時間以確保線性化。
反向PCR法
在載體克隆位點兩側設計一對反向引物，通過PCR擴增獲取線性化載體片段。
關鍵點：使用高保真DNA聚合酶(如Phusion或Q5)擴增，避免堿基突變；擴增產物需通過膠回收純化，去除環狀模板質粒。
二、插入片段制備
引物設計
在插入片段的正反向引物5’端引入與線性化載體末端一致的同源序列(15-25 bp)。
示例：
正向引物：5’-上游載體同源序列(15-25 bp)+插入片段特異性序列-3’
反向引物：5’-下游載體同源序列(15-25 bp)+插入片段特異性序列-3’
注意事項：
同源序列Tm值需≥48℃，可通過公式計算(A-T堿基對=2°C，G-C堿基對=4°C)。
若載體為粘性末端且3’端突出，引物設計需包含突出部分；若5’端突出，則可選擇性包含。
避免在同源序列中引入酶切位點，除非需保留重組后位點。
PCR擴增
使用高保真DNA聚合酶擴增插入片段，擴增產物需通過凝膠電泳分離并回收。
特殊情況處理：若擴增模板為環狀質粒，建議用Dpn I消化模板DNA，避免殘留質粒干擾重組反應。
三、重組反應與轉化
重組反應體系配制
推薦比例：
線性化載體用量(ng)= 0.02 × 載體堿基對數(如5 kb載體需100 ng)。
插入片段用量(ng)= 0.04 × 片段堿基對數(單片段)或 0.02 × 片段堿基對數(多片段)。
若插入片段長度小于200 bp，需使用5倍載體用量。
反應條件：將線性化載體、插入片段與2× Cloning Master Mix混合后，50℃孵育15-60分鐘(片段數量與長度影響反應時間，如2-3個片段反應20分鐘，4-6個片段反應60分鐘)。
轉化與篩選
熱激轉化：
取100 μL冰浴融化的感受態細胞(如DH5α)，加入5-10 μL重組產物，輕輕混勻后冰浴30分鐘。
42℃水浴熱激45-90秒，迅速轉移至冰浴中靜置2分鐘。
加入500 μL無抗生素LB培養基，37℃、200 rpm復蘇1小時。
涂布平板：取100-300 μL復蘇液均勻涂布于含相應抗生素的LB平板，37℃倒置培養過夜。
陽性克隆鑒定：
菌落PCR：用槍頭挑取單菌落至10 μL無菌水中混勻，取1 μL為模板進行PCR擴增(建議使用載體通用引物或特異性引物)。
酶切鑒定：提取質粒后用相應內切酶酶切，電泳檢測片段大小。
測序驗證：對陽性克隆進行測序，確認插入片段序列正確性。
熱門搜索：
轉染試劑（Lipo3000）
Sybr Gold核酸染料
M1050-10mlMBP標簽親和填料 （麥芽糖結合蛋白）
500bp DNA Marker
(N30210-1L)Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)
P0105一步法SDS-PAGE AB液快速制膠試劑盒10％
P10310預染蛋白Marker 10-310KD
M1050-100mlMBP標簽親和填料 （麥芽糖結合蛋白）
Y0003-250g(50g/L)YPDPlus培養基
Ni NTA Beads 6FF(鎳填料)
DNA Assembly Mix Plus無縫克隆
P1025預染蛋白Marker(10-250KD）
M0500-500ml膜再生液
金擔子素A
P1018-預染蛋白Marker 10-180KD
1kb Plus DNA Marker
更新時間：2025-08-15
點擊次數：608
當前位置：
